FAQs – Häufig gestellte Fragen

• Wie entsteht Gebärmutterhalskrebs und seine Vorläufer?
• Was ist HPV?
• Was sind "High Risk" und "Low Risk"-HPV?
• Was wird mit einem DNS-basierten HPV-Test nachgewiesen?
• Was wird mit einem HPV-Test nachgewiesen, der auf Antikörpern gegen virale Kapsid-Proteine basiert?

• Was ist p16^INK4a?
• Gibt es Unterschiede im Färbungsmuster von p16^INK4a in dysplastischen oder neoplastischen Zellen mit episomalem HPV-Genom im Vergleich zu Zellen, in denen die HPV-DNS in die chromosomale DNS der Wirtszellen integriert ist?
• Worin unterscheidet sich der Nachweis bei p16^INK4a und bei Ki67?
• Warum sollten CINtec®-Kits anstatt eines einzelnen Antikörpers verwendet werden?

• Sind CINtec® Histology und CINtec® Cytology austauschbar?

• Was wird mit dem CINtec® p16^INK4a Cytology Kit nachgewiesen?
• Kann das CINtec® p16^INK4a Cytology Kit zum Nachweis von HPV verwendet werden?
• Sind CINtec® Histology und CINtec® Cytology austauschbar?

• Wie sollten die CINtec® p16^INK4a Kits aufbewahrt werden?
• Welches Nachweissystem wird in den CINtec® p16^INK4a Kits verwendet?
• Welche Art der Vorbehandlung wird verwendet?
• Welches Chromogen wird verwendet (DAB, AEC oder ein anderes)?
• Welche Art von Waschpuffer wird für die Waschvorgänge benötigt, oder wird der Waschpuffer in den Kits mitgeliefert?
• Für wie viele Tests reicht das Kit?

• Mit welchen Plattformen sind CINtec®-Produkte kompatibel?
• Sind die Inhalte der Kits als Konzentrat oder in gebrauchsfertiger Form erhältlich?

Wie entstehen Gebärmutterhalskrebs und seine Vorläufer?
Jedes Jahr werden weltweit 450.000 neue Fälle von Gebärmutterhalskrebs registriert. Diese Krebsart entwickelt sich über einen längeren Zeitraum hinweg aus einer Reihe von Vorläuferläsionen.

Was ist HPV?
Humane Papillomviren (HPV) sind eine Gruppe ähnlicher Viren, die Epithelzellen der Haut und der Schleimhäute befallen und durch unkontrollierte Vermehrung der Wirtszellen zur Bildung von Hautwarzen und Kondylomen an den Schleimhäuten führen. Bislang konnten durch Untersuchungen der viralen DNS-Sequenz mehr als 100 Typen von HP-Viren identifiziert werden. Von mindestens 23 HPV-Arten ist bekannt, dass sie das Zervixepithel befallen. Die anogenitalen Infektionen werden in der Regel durch den Geschlechtsverkehr übertragen. Bis zu 30% aller Frauen bis 30 Jahre sind mit HPV infiziert. Der weitaus größte Teil der HPV-Infektionen heilt unbemerkt von alleine ab. Bei einem kleinen Prozentsatz von Frauen dauert die Infektion jedoch an und gibt damit manchen Viren die Möglichkeit, ihr krebserregendes Potenzial zu entfalten.

Was sind "High Risk"- und "Low Risk"-HPV?
Humane Papillomviren, die Schleimhäute befallen, werden entsprechend ihrer zellverändernden Eigenschaften in zwei Gruppen eingeteilt: Die "High Risk" (Hochrisiko)-HPV (z. B. 16, 18, 31, 35, 45 und andere) können zervikale Dysplasien und Karzinome erzeugen, wohingegen "Low Risk" (Niedrigrisiko)-HPV (z. B. 6, 11, 40 und 42) nur in außergewöhnlichen Fällen eine Zellveränderung herbeiführen. Das onkogene Potenzial der "High Risk"-HPV ist durch die Genprodukte ihrer Gene E6 und E7 bedingt.

Was wird mit einem DNS-basierten HPV-Test nachgewiesen?
Ein HPV-Test weist die virale DNS, also eine HPV-Infektion nach, aber eben auch Infektionen mit Viren, die vom körpereigenen Immunsystem kontrolliert werden können und deshalb nicht zur Ausbildung von Gebärmutterhalskrebs und seinen Vorläuferläsionen führen. Der HPV-Test kann lediglich als Hinweis auf ein erhöhtes absolutes Risiko (im Vergleich zur gesamten weiblichen Bevölkerung) für die Entwicklung einer präneoplastischen Läsion oder eines Zervixkarzinoms betrachtet werden.

Was wird mit einem HPV-Test nachgewiesen, der auf Antikörpern gegen virale Kapsid-Proteine basiert?
Manche HPV-Tests sind immunchemische, d.h. Antikörper-basierende Nachweise viraler Kapsid-Antigene. Virale Kapsid-Proteine weisen eher auf eine akute HPV-Infektion hin. Eine Überexpression von p16^INK4a ist dagegen in der Regel ein Hinweis für eine onkogene Transformation der Zelle nach persistierender Infektion mit einem HR-HPV Typ.In der Regel findet die Virenreplikation in differenzierten Keratinozyten statt. Unter dem Einfluss der viralen Proteine liefert die Wirtszelle alle für die Herstellung neuer infektiöser Partikel benötigten Komponenten. Die viralen Kapsid-Proteine werden also in sich differenzierenden Epithelzellen exprimiert. In der HPV-bedingten Karzinogenese werden normale zelluläre Vorgänge wie etwa die Differenzierung stark gestört; mit fortschreitender Transformation wird aber die "korrekte" Verbreitung der Viren verhindert. Daher lässt sich eine Expression von viralen Kapsid-Proteinen in hochgradigen Läsionen und invasiven Zervixkarzinomen nur selten nachweisen, obwohl genetisches Material des HPVvorhanden ist.

Was ist p16^INK4a?
p16^INK4a ist ein zyklinabhängiger Kinaseinhibitor. Dieses Protein spielt eine entscheidende Rolle bei der durch das Retinoblastomprotein (pRB) vermittelten Steuerung des Zellzyklus. Eine verminderte p16^INK4a-Expression oder funktionelle Inaktivierung von p16^INK4a wurde bei vielen Tumoren nachgewiesen. Dagegen ist für manche Krebsarten wie beispielsweise das Zervixkarzinom eine starke Überexpression des p16^INK4a-Proteins beschrieben.

Gibt es Unterschiede im Färbungsmuster von p16^INK4a in dysplastischen oder neoplastischen Zellen mit episomalem HPV-Genom im Vergleich zu Zellen, in denen die HPV-DNS in die chromosomale DNS der Wirtszellen integriert ist?
Bisher gibt es keinen Hinweis auf Unterschiede im Färbungsmuster von p16^INK4a bei episomalen und integrierten Formen der HPV-DNS. Bei einer Karzinogenese infolge einer HPV-Infektion sind Störungen des Spindelmechanismus bei der Zellteilung ein bekanntes Phänomen. Dies gilt als begünstigender Faktor für das Auseinanderbrechen und die Rekombination von Chromosomen, die zu einer Integration episomaler Virus-DNS in das Wirtsgenom führt. Eine Überexpression von p16^INK4a sollte unabhängig davon erkannt werden, ob das HPV-Genom integriert oder episomal ist.

Worin unterscheidet sich die Erkennung von p16^INK4a und Ki67?
p16^INK4a ist ein zelluläres Protein, welches im Verlauf einer durch Hochrisiko-HPV bedingten onkogenen Zellveränderung signifikant überexprimiert wird und daher im Zusammenhang mit der Krankheitsentwicklung steht. Im Gegensatz dazu dient das Antigen Ki67 als Marker für eine Zellproliferation, wobei nicht zwischen harmloser und krankhafter Zellvermehrung unterschieden wird. Die Unterschiede zwischen den beiden Testmethoden ergeben sich aus dem Färbungsmuster und den Zellarten, die gefärbt werden; so färbt Ki67 z.B. auch Entzündungszellen.

Warum sollte CINtec®-Kits anstatt eines einzelnen Antikörpers verwendet werden?
CINtec®-Kits sind reinen Antikörper-Tests überlegen und bieten dem Anwender folgende Vorteile:

• Der Antikörperklon E6H4^TM wurde gezielt für die sensible und spezifische Erkennung einer Überexpression von p16^INK4a in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten und in alkoholfixierten Zellpräparaten entwickelt und ausgewählt. Die Spezifität und Leistungsfähigkeit des optimierten Antikörperklons E6H4^TM wurde in einer langen Reihe durch Fachleute geprüfter klinischer Veröffentlichungen belegt.
• Es ist ein einfaches Zweischritt-Verfahren mit reproduzierbaren, klinisch relevanten Ergebnissen.
• Die Herstellung nach GMP (Good Manufacturing Practice) sorgt für gleichbleibende Zuverlässigkeit bei jeder Charge. In Europa tragen die Produkte die CE-Kennzeichnung, in den USA werden sie als In-vitro-Diagnostika (IVD) der Klasse 1 vertrieben.
• Bei der Preisgestaltung sind die Kosten für einzelne Antikörper, sekundäre Reagenzien, zusätzlichen Arbeitsaufwand, wiederholte Validierung und andere Hilfsreagenzien sowie weitere Komponenten zu berücksichtigen.
• mtm laboratories AG führt groß angelegte klinische Studien durch, um den signifikanten klinischen Nutzen der CINtec®-Produkte nachzuweisen.

Sind CINtec® Histology und CINtec® Cytology austauschbar?
Nein. Es handelt sich um unterschiedliche Produkte mit unterschiedlichen Verfahren. Bei einem Austausch liefern sie nicht dieselben Ergebnisse. Jedes Set von Reagenzien wurde gezielt für seinen Anwendungsbereich entwickelt und optimiert:

• CINtec® Histology für Gewebe aus Biopsien und
• CINtec® Cytology für zytologische Proben

Was wird mit dem CINtec® Cytology Kit nachgewiesen?
Das Kit färbt Zellen mit einer Überexpression von p16^INK4a in Abstrichen der Zervixschleimhaut. Mittels eines entsprechenden Entnahmeinstruments werden Proben entnommen und in herkömmlicher Weise auf einen Objektträger aufgebracht oder mithilfe des Liquid Based Cytology (LBC) Verfahrens vorbereitet.

Kann das CINtec® p16^INK4a Cytology Kit zum Nachweis von HPV verwendet werden?
Nein. Bei p16^INK4a handelt es sich um ein zelluläres, kein virales Protein.
HPV-Infektionen sind weit verbreitet. In der Regel sind sie nicht von Dauer und heilen innerhalb einiger Monate von selbst aus. Nur ein kleiner Prozentsatz der Infektionen bleibt langfristig (persistierend) bestehen, so dass sich das onkogene Potenzial des HR-HPV entfalten kann.Üblicherweise findet die Virusreplikation in reifenden Keratinozyten statt, die sich nicht teilen. Diese Zellen differenzieren sich; sie vermehren sich nicht und geben den Onkogenen damit keine Möglichkeit, in die Steuerung des Zellzyklus einzugreifen. Infolge noch unbekannter Mechanismen kommt es in einigen Fällen dennoch zur Expression der viralen Onkogene in replikationskompetenten, undifferenzierten Basalzellen des Zervixepithels und damit zur Ausbildung von präneoplastischen und neoplastischen Läsionen. Nur die Expression des viralen E7-Onkogens in diesen replikationskompetenten Zellen führt zur Dyskaryose im Zervixepithel und zu einer Überexpression von p16^INK4a.

Wie sollten die CINtec®-Kits aufbewahrt werden?
Die CINtec®-Kits müssen bei einer Temperatur von 2-8 Grad Celsius aufbewahrt werden.

Welches Nachweissystem wird in den CINtec®-Kits verwendet?
Die mtm laboratories AG CINtec®-Kits stellen ein Zweischritt-Verfahren basierend auf einem mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierten Polymerreagenz zur Signalerzeugung zur Verfügung.

Welche Art der Vorbehandlung wird verwendet?
Zum Verfahren der CINtec®-Kits gehört eine wärmeinduzierte Epitopdemaskierung mithilfe einer speziellen im Kit enthaltenen Demaskierungslösung. Das für das Kit validierte Protokoll beinhaltet eine Inkubationszeit von 10 min. bei 95 Grad Celsius im Wasserbad.

Welches Chromogen wird verwendet (DAB, AEC oder ein anderes)?
Das verwendete Chromogen ist DAB; dabei handelt es sich um ein Zweikomponentensystem, mit dem die DAB-Chromogenlösung angesetzt wird.

Welche Art von Waschpuffer wird für die Waschvorgänge benötigt? Wird der Waschpuffer in den Kits mitgeliefert?
Der Waschpuffer ist ein zehnfach konzentrierter, Tris/HCI-basierter Puffer (pH-Wert 7,6) mit Reinigungsmittel und einem antimikrobiellem Zusatz. Das Produkt wird in einer 1-Liter-Flasche geliefert. Dieser Waschpuffer wird als separates Produkt zur Verwendung mit dem Kit geliefert, d.h. er ist nicht in der Originalverpackung des CINtec®-Kit enthalten, sondern wird parallel zu jeder Bestellung eines CINtec®-Kit geliefert.
Bei Bedarf kann der Waschpuffer unabhängig vom CINtec®-Kit nachbestellt und versandt werden.

Für wie viele Tests reicht das Kit?
Das CINtec® Histology Kit enthält genügend Reagenzien für je 50 mit p16^INK4a gefärbte sowie 50 mit der negativen Reagenzkontrolle gefärbte Objektträger. CINtec® Cytology beinhaltet 50 Tests pro Kit ohne zusätzliche Kontrollen. Die Anzahl der Tests pro Kit basiert auf einer Menge von 200 µL Reagenz pro Objektträger.

Mit welchen Plattformen sind CINtec®-Produkte kompatibel?
CINtec®-Produkte sind mit folgenden Plattformen kompatibel:

• manuelle Immunfärbeverfahren
• Autostainer (Labvision, Dako) und
• Ventana Benchmark.

Sind die Inhalte der Kits als Konzentrat oder in gebrauchsfertiger Form erhältlich?
Die primären Antikörper-Reagenzien, d.h. der p16^INK4a-spezifische monoklonale Antikörper E6H4^TM und der als negative Reagenzkontrolle verwendete Isotyp-Kontrollantikörper (CINtec® Histology Kit) sowie das sekundäre Reagenz sind gebrauchsfertige Lösungen. Die Antikörpermenge im Kit basiert auf 200 µL pro Test. Der Waschpuffer und die Epitopdemaskierungslösung sind zehnfach konzentrierte Lösungen zum Mischen mit Wasser.