FAQs - Domande più frequenti

• Come si sviluppano il cancro cervicale e le lesioni pre-neoplastiche?
• Cos`è l`HPV?
• Cosa sono gli HPV ad alto e a basso rischio?
• Cosa si riscontra in un test HPV basato sul DNA?
• Cosa si riscontra in un test HPV, basato su anticorpi contro proteine del capside virale?

• Cos`è la p16<sup>INK4a</sup>?
• Ci sono differenze nel pattern di colorazione del p16<sup>INK4a</sup> in cellule displastiche o neoplastiche, dove il genoma dell`HPV è episomiale rispetto alle cellule in cui il DNA dell`HPV è integrato nel DNA cromosomico delle cellule ospite?
• Come si differenzia l`identificazione della p16^INK4a rispetto all`identificazione del Ki67?
• Perché utilizzare il Kit CINtec® invece di un singolo anticorpo?

• Posso utilizzare indifferentemente CINtec® Histology e CINtec® Cytology?

• Cosa viene identificato dal CINtec® Cytology Kit?
• Si può usare il CINtec® Cytology Kit per l`identificazione dell`HPV?
• Posso utilizzare indifferentemente CINtec® Histology e CINtec® Cytology?

• Quali sono le condizioni di conservazione adeguate per i kits CINtec®?
• Che sistema di identificazione comprendono i kits CINtec®?
• Che tipo di pretrattamento viene fornito?
• Che cromogeno viene fornito (DAB, AEC o altro)?
• Che tipo di tampone di lavaggio occorre utilizzare per le fasi di lavaggio oppure ne viene fornito uno in dotazione con i kit?
• Quanti test per kit vengono forniti?

• Con che piattaforme sono compatibili i prodotti CINtec®?
• I contenuti del kit sono disponibili in forma concentrata o solo nella forma pronta all`uso?

Come si sviluppano il cancro cervicale ed i suoi precursori?
Ogni anno si registrano in tutto il mondo circa 450.000 nuovi casi di cancro cervicale. Il cancro cervicale si sviluppa gradualmente nell`arco di un lungo periodo di tempo attraverso una sequenza di lesioni pre-neoplastiche. È stato dimostrato che infezioni persistenti di Papilloma Virus Umani ad alto rischio (HR-HPV) sono coinvolte nella patogenesi del cancro cervicale e dei suoi precursori.

Cos`è l`HPV?
I Papilloma Virus Umani (HPV) sono un gruppo di virus strettamente correlati che infettano gli epiteli squamosi stratificati cutanei e mucosi, determinando la proliferazione della cellula ospite e provocando ad esempio verruche o condilomi sulla mucosa. Attualmente si conoscono più di 100 tipi di HPV, definiti sulla base dell`omologia della sequenza del DNA. È stato osservato che almeno 23 tipi di HPV infettano l`epitelio cervicale. Le infezioni anogenitali sono generalmente a trasmissione sessuale e, un'infezione da HPV può essere individuata nel 30% dei casi. La grande maggioranza delle infezioni da HPV guarisce senza essere diagnosticata, tuttavia, in una piccola percentuale di donne l`infezione persiste ed il potenziale oncogeno di alcuni di questi virus può svilupparsi.

Cosa sono gli HPV ad alto e a basso rischio?
Sono stati identificati due gruppi di HPV a rischio differente, in funzione della loro capacità di trasformazione cellulare. Gli HPV ad alto rischio (ad es. 16, 18, 31, 35, 45 ed altri) sono in grado di causare displasie e carcinomi cervicali, mentre gli HPV a basso rischio (ad es. 6, 11, 40, e 42) evidenziano capacità di trasformazione solo in casi eccezionali. I prodotti dei geni E6 e E7 HPV ad alto rischio mediano il potenziale oncogeno di questi virus.

Cosa si riscontra in un test HPV basato sul DNA?
Un test HPV positivo mostra un`infezione da virus. Dal momento che la maggior parte delle infezioni viene debellata dal sistema immunitario senza dare origine ad un cancro cervicale o a suoi precursori, un test HPV(DNA) positivo rappresenta solo un`indicazione che la donna è soggetta a un rischio assoluto leggermente maggiore (rispetto alla popolazione femminile totale) di sviluppare una lesione pre-neoplastica o un cancro cervicale.

Cosa si riscontra in un test HPV, basato su anticorpi contro proteine del capside virale?
Alcuni test HPV si basano sull`identificazione degli antigeni del capside virale. Generalmente la replicazione virale avviene nei cheratinociti differenziati che in condizioni normali non proliferano impedendo agli oncogeni virali di influenzare il normale ciclo riproduttivo cellulare. Tuttavia, talvolta, seguendo meccanismi ancora sconosciuti, gli oncogeni virali possono esprimersi a livello dello strato basale dell`epitelio, nelle cellule non differenziate capaci di riprodursi. .Pertanto raramente si rileva l'espressione delle proteine del capside virale in lesioni di grado elevato e in carcinomi cervicali invasivi, sebbene si riscontri materiale genetico di HPV. L`identificazione delle proteine del capside virale è più una caratteristica di un'infezione acuta da HPV, rispetto all`iper-espressione della p16^INK4a che indica un'infezione HPV in trasformazione.

Cos`è la p16<sup>INK4a</sup>?
La p16<sup>INK4a</sup> è un inibitore della chinasi ciclina-dipendente. Questa proteina svolge un ruolo fondamentale nel controllo mediato dalla proteina del retinoblastoma (pRB) della transizione della fase G1-S del ciclo cellulare. La perdita dell?espressione della p16<sup>INK4a</sup> o un`inattivazione funzionale della p16^INK4a è stata osservata in molte entità tumorali. Al contrario, per alcune entità tumorali, incluso il cancro cervicale, è stata evidenziata una forte iper-espressione della p16^INK4a.

Esistono differenze nel pattern di colorazione della p16^INK4a in cellule displastiche o neoplastiche dove il genoma dell`HPV è episomiale rispetto alle cellule in cui il DNA dell`HPV è integrato nel DNA cromosomico delle cellule ospite?
Al momento non sono state evidenziate differenze nei pattern di colorazione della p16^INK4a in relazione alle forme episomiali rispetto a quelle integrate di DNA dell`HPV. Nella causa della carcinogenesi collegata all`HPV le perturbazioni del polo del fuso mitotico nelle cellule in proliferazione sono un fenomeno noto. Questo è considerato un forte promotore della rottura e ricombinazione cromosomica che conduce all`integrazione di DNA virale episomiale nel genoma ospite. L`iper-espressione della p16^INK4a, comunque, deve essere rilevata indipendentemente dal fatto che il genoma dell`HPV sia integrato o episomiale.

Come si differenzia l`identificazione della p16<sup>INK4a</sup> rispetto all`identificazione del Ki67?
La p16^INK4a è una proteina cellulare caratterizzata da una notevole iper-espressione durante la trasformazione oncogena cellulare dell`HR-HPV, pertanto è collegata allo sviluppo della patologia. Al contrario, il Ki67 è un antigene associato alla proliferazione, ovvero un marcatore di proliferazione cellulare (non in grado di distinguere fra proliferazione cellulare sana o patologica). Le differenze fra i due metodi di test sono ovvie sia per quanto riguarda il pattern di colorazione sia per il tipo di cellule colorate, infatti il Ki67 colora anche cellule infiammatorie.

Perché utilizzare il Kit CINtec® invece di un singolo anticorpo?
Nel decidere di utilizzare un anticorpo per identificare la p16^INK4a è importante tenere in considerazione, innanzitutto, una serie di fattori. I Kits CINtec® consentono al medico di beneficiare di quanto segue:

• Il clone dell`anticorpo E6H4<sup>TM</sup> è stato specificamente progettato e selezionato per consentire l`identificazione sensibile e specifica dell`iper-espressione della p16<sup>INK4a</sup> sia in sezioni di tessuto incluse in paraffina e fissate in formalina, sia in preparati citologici cervicali. La specificità e la performance del clone dell`anticorpo ottimizzato E6H4^TM è stata dimostrata in un gran numero di pubblicazioni cliniche revisionate tra pari.
• Semplice, processo in 2 fasi convalidato per fornire un risultato riproducibile, clinicamente rilevante.
• Fabbricato secondo le GMP per garantire l`affidabilità di ogni lotto. I prodotti sono autorizzati a riportare i marchi CE in Europa e verranno commercializzati come IVD di classe 1 negli Stati Uniti.
• Il costo dei singoli anticorpi, dei reagenti secondari, del lavoro supplementare, della valutazione ripetuta e di altri reagenti aggiuntivi deve essere considerato parte del prezzo come altre componenti.
• mtm laboratories sta effettuando studi clinici approfonditi atti a dimostrare la significativa utilità clinica dei prodotti CINtec®.

Posso utilizzare indifferentemente CINtec® Histology e CINtec® Cytology?
No, si tratta di prodotti diversi con protocolli di applicazione differenti. Se vengono scambiati si ottengono risultati diversi. Ogni set di reagente è stato specificamente sviluppato e ottimizzato per la sua applicazione specifica.

• CINtec® Histology su tessuto bioptico
• CINtec® Cytology su campioni citologici

Cosa viene identificato dal Kit CINtec® Cytology?
Il kit colora le cellule che iper-esprimono la p16^INK4a in campioni citologici della cervice. I campioni vengono prelevati con un dispositivo di campionamento e strisciati sul vetrino in modo convenzionale o preparati con la tecnica della citologia in fase liquida (LBC).

Si può usare il CINtec® Cytology Kit per l`identificazione dell`HPV?
No. La p16^INK4a è una proteina cellulare, non una proteina virale. L`infezione da HPV è abbastanza comune. Si tratta di un`infezione generalmente transitoria che regredisce spontaneamente nell`arco di alcuni mesi. Solo una piccola percentuale di infezioni persiste facendo sviluppare il potenziale oncogeno dell`HR-HPV.Normalmente la replicazione del virus si verifica nei cheratinociti in maturazione. Queste cellule sono in fase di differenziazione; non proliferano e non danno opportunità agli oncogeni di interferire con la regolazione del ciclo cellulare. Tuttavia, a causa di meccanismi ancora sconosciuti, in alcuni casi gli oncogeni virali vengono espressi in cellule basali indifferenziate, replicazione-competenti dell`epitelio cervicale che possono dare origine a lesioni preneoplastiche e neoplastiche. Solo l`espressione dell`oncogeno virale E7 in queste cellule replicazione-competenti determinerà discariosi nell'epitelio cervicale e si potrà riscontrare iper-espressione della p16^INK4a.

Posso utilizzare indifferentemente CINtec® Histology e CINtec® Cytology?
No, si tratta di prodotti diversi con protocolli differenti. Se vengono scambiati si ottengono risultati diversi. Ogni set di reagente è stato sviluppato e ottimizzato per la sua applicazione specifica.

• CINtec® Histology su tessuto bioptico
• CINtec® Cytology su campioni citologici

Quali sono le condizioni di conservazione adeguate per i Kits CINtec®?
I Kits CINtec® devono essere refrigerati a 2-8 gradi centigradi.

Che sistema di identificazione comprendono i Kits CINtec®?
I Kits CINtec® di mtm laboratories forniscono un protocollo in due fasi basato su un reagente di polimero coniugato con perossidasi di rafano per la generazione del segnale.

Che tipo di pretrattamento viene fornito?
Il kit CINtec® prevede una fase di smascheramento termo-indotta dell`epitopo che utilizza soluzioni specifiche fornite in dotazione con i kits. Il protocollo approvato per il kit prevede un periodo di incubazione di 10 min in un bagnomaria a 95° gradi centigradi.

Che cromogeno viene fornito (DAB, AEC o altro)?
Il cromogeno fornito è DAB, un sistema composto da due prodotti utilizzato per preparare la soluzione finale di lavoro.

Che tipo di tampone di lavaggio occorre utilizzare per le fasi di lavaggio oppure ne viene fornito uno incluso nei kit?
Il tampone di lavaggio è un tampone Tris/HCl concentrato 10x (pH 7.6) con detergente e un agente antimicrobico. Il prodotto è fornito in unità da un litro in flaconi adeguati. Questo tampone di lavaggio è un prodotto fornito separatamente da utilizzare con il kit, non è confezionato con la scatola originale del CINtec® Kit, ma viene fornito e spedito con ogni Kit CINtec® ordinato. Se necessario, forniture supplementari del tampone di lavaggio possono essere ordinate e spedite separatamente dal kit CINtec®.

Quanti test per kit vengono forniti?
Per il CINtec® Histology Kit abbiamo incluso reagenti per 50 vetrini colorati per p16^INK4a e per 50 vetrini colorati con il Reagente di Controllo Negativo. CINtec® Cytology contiene 50 test per kit senza controlli aggiuntivi. Il numero di test per kit presuppone l`utilizzo di 200 µL di reagente per vetrino.

Con che piattaforme sono compatibili i prodotti CINtec®?
I prodotti CINtec® sono compatibili con le seguenti piattaforme:

• Immunocolorazione manuale
• Autocolorazoine (Labvision, Dako)
• Ventana Benchmark

I contenuti del kit sono disponibili in forma concentrata o in forma pronta all`uso?
I reagenti anticorpali primari, ovvero l`anticorpo monoclonale E6H4^TM specifico per p16^INK4a e l`anticorpo di controllo dell`isotopo utilizzati come Reagente di Controllo Negativo (CINtec® Histology Kit), nonché il reagente secondario, sono soluzioni pronte all`uso. La quantità di anticorpo nel kit presuppone l`utilizzo di 200µL per test. Il tampone di lavaggio e il tampone per lo smascheramento dell`epitopo sono soluzioni concentrate 10x da diluire con acqua.